微生物限度過(guò)濾的所有驗(yàn)證方法的操作都需要在陽(yáng)性接種間完成。

**、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)法的驗(yàn)證

驗(yàn)證方法 取試驗(yàn)可能用的*低稀釋級(jí)供試液進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證試驗(yàn)至少應(yīng)進(jìn)行 3 次**的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌株每次試驗(yàn)的回收率。

    1.常規(guī)法

    就是取1∶10的供試液lml和 50~100個(gè)試驗(yàn)菌株加入到1個(gè)平皿中，立即傾注相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平        皿，培養(yǎng)，計(jì)算各菌株的回收率。

    常規(guī)法做一個(gè)樣品的**、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證試驗(yàn)，需要多少個(gè)平皿呢?

        試驗(yàn)組∶5×2=10個(gè)，即每個(gè)菌株做2ml共需10個(gè)

        菌液組∶5×2=10個(gè)，即每個(gè)菌株的加菌量，每株2個(gè)皿        共24個(gè)

        本底菌組∶2個(gè)**計(jì)數(shù)，2個(gè)霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)

    **計(jì)數(shù)驗(yàn)證所用的平皿共14個(gè)，其中6個(gè)用于試驗(yàn)組計(jì)數(shù)，6個(gè)用于菌液組計(jì)數(shù)，2個(gè)用于**本底菌計(jì)數(shù)，傾倒?fàn)I養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基;霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)所用的平皿共10 個(gè)，其中4個(gè)用于試驗(yàn)組計(jì)數(shù)，4個(gè)用于菌液組計(jì)數(shù)，2個(gè)用于霉菌本底菌計(jì)數(shù)，傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（虎紅瓊脂培養(yǎng)基）。

    回收率=【（試驗(yàn)組菌數(shù)-本底菌組菌數(shù)/菌液組菌數(shù)】

    當(dāng)大腸埃希菌，金**葡萄球菌，枯草桿菌3個(gè)菌株的回收率均達(dá)到70%以上時(shí)，**計(jì)數(shù)用該驗(yàn)證的方法檢驗(yàn)。

    當(dāng)白色***和黑曲霉 2個(gè)菌株的回收率均達(dá)到70%以上時(shí)，霉菌計(jì)數(shù)用該驗(yàn)證的方法檢驗(yàn)。

    2.培養(yǎng)基稀釋法

    取規(guī)定量的供試液，至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內(nèi)的供試品含量減少，至不含抑菌作用。測(cè)定**、霉菌及酵母菌的菌數(shù)時(shí)，取同稀釋級(jí)的供試液 2ml，每lml供試液可等量分注多個(gè)平皿，傾注瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。每lml 供試液所注的平皿中生長(zhǎng)的菌數(shù)之和即為 1ml的菌落數(shù)，計(jì)算每 1ml 供試液的平均菌落數(shù)，按平皿法計(jì)數(shù)規(guī)則報(bào)告菌數(shù);控制菌檢查時(shí)，可加大增菌培養(yǎng)基的用量。

    具體操作∶（以1ml分至5個(gè)皿為例）

    就是取1∶10的供試液 1ml均勻分注到5個(gè)平皿中，每個(gè)皿0.2ml，每株試驗(yàn)菌平行制備 2ml的平皿數(shù)，然后加入相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)，計(jì)算各菌株的回收率。

    用該法做一個(gè)樣品的**、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證試驗(yàn)，需要多少個(gè)平皿呢?

        試驗(yàn)組∶5×10=50個(gè)，即每個(gè)菌株做2ml共需50個(gè)

        菌液組∶5×2=10個(gè)，即每個(gè)菌株的加菌量，每株 2個(gè)皿       共80個(gè)

        本底菌組∶10個(gè)**計(jì)數(shù)，10個(gè)霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)

    3.離心沉淀集菌法

    取一定量的供試液，3000轉(zhuǎn)/分離心 20分鐘（供試液如有沉淀，先以 500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，取全部上清液再離心），棄去上清液，留底部集菌液約2ml，加稀釋液補(bǔ)至原量。然后用此稀釋液進(jìn)行檢驗(yàn)。

    4.薄膜過(guò)濾法

    取相當(dāng)于每張濾膜含1g 或lml供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中，混勻，過(guò)濾。若供試品每 1g 或 lml所含的菌數(shù)較多時(shí)，可取適宜稀釋級(jí)的供試液 lml，過(guò)濾。用 pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或**瓊脂培養(yǎng)上。每種菌株至少制備一張濾膜。即每個(gè)驗(yàn)證樣品至少制備7個(gè)膜。（5個(gè)試驗(yàn)組和 2個(gè)本底菌）